Nedstrøms ultrafiltrerings-/diafiltreringskonsentrasjonsprosess: Hvordan effektivt forhindre målproteingjennomtrengning og tap

Nedstrøms ultrafiltrerings-/diafiltreringskonsentrasjonsprosess: Hvordan effektivt forhindre målproteinpermeasjon og tap

I nedstrøms renseprosesser for rekombinante proteiner, blodprodukter og andre biologiske stoffer, brukes ultrafiltrering/diafiltrering (UF/DF) for råstoffkonsentrasjon, bufferutveksling og fjerning av salter og små-molekylære urenheter. Separasjon oppnås basert på membransikting: store molekyler som monoklonale antistoffer (mAbs) holdes tilbake av membranen, mens salter, endotoksiner, frie vertscelleproteiner (HCP) og andre små-molekylære urenheter passerer gjennom membranen og fjernes i permeatet. Under prosessoppskalering- kan målproteintap gjennom membranen lett oppstå, noe som direkte reduserer utbyttet og øker batchkostnadene. Under noen driftsforhold kan protein påvises i permeatet, noe som krever rask bestemmelse av om de lekkede komponentene er intakt mål-mAb, nedbrutt/fragmenterte aggregater eller vertscelleproteiner. Denne artikkelen er delt inn i to hoveddeler: den gjennomgår tradisjonelle prosess-kontrolltilnærminger og, i kombinasjon med Design of Experiments (DOE), etablerer den et robust prosessvindu, støttet av flere analytiske metoder for å bestemme identiteten til proteiner oppdaget i permeatet.

 

 

I. Hovedårsaker til målproteinpermeasjon gjennom membranen under UF/DF

1. For høyt transmembrantrykk (TMP)
Når trykkforskjellen over membranen er for høy, økes løsemiddelmotstanden, noe som tvinger noe monomert protein inn i permeatet. Under oppskalering- inneholder matetanken et større volum av materiale og trykksvingninger i rørene er mer uttalte, noe som gjør forbigående overtrykk mer sannsynlig enn i laboratorieskala.

2. Feil tangentiell strømningshastighet
Hvis strømningshastigheten er for lav, dannes det et tett konsentrasjon-polarisasjonslag på membranoverflaten, og den lokale proteinkonsentrasjonen kan overstige membranens toleranseterskel. Hvis strømningshastigheten er for høy, kan skjærspenning forårsake strukturell spaltning av mAb, og generere mindre proteinfragmenter som kan passere fritt gjennom membranporene.

3. For høy proteinkonsentrasjon i råstoffet
Når proteinkonsentrasjonen i fôret er for høy, akkumuleres protein på membranoverflaten, og noe monomert protein kan føres inn i permeatet. Dette er et vanlig problem i stor-produksjon.

4. pH eller ledningsevne utenfor prosessområdet
Endringer i proteinets ladningsegenskaper kan redusere dets hydreringsradius og tilsynelatende partikkelstørrelse, noe som resulterer i unormal membrangjennomtrengning.

5. Membrankassettaldring, høy diffusiv fluks eller utilstrekkelig pre-kondisjonering
Fysiske defekter i membrankassetten kan direkte forårsake proteinlekkasje og representere en utstyrsrelatert-risiko. Gjentatt CIP med sterkt alkaliske løsninger kan gradvis skade polyetersulfon (PES) membranmaterialet.

6. For stort diafiltreringsvolum
Under langvarig diafiltrering kan kontinuerlig skylling av løsemidler gradvis fjerne små mengder monomert protein.

 

II. Tradisjonelle praktiske tiltak for å forhindre gjennomtrenging og tap av målprotein

(A) Prosessparameterkontroll

1. Kontroller transmembrantrykk (TMP)
Definer en øvre trykkadvarselsgrense og opprett forriglingsalarmer for å forhindre forbigående høytrykkspåvirkninger på membranlaget. Etter å ha bestemt grunnlinjeparametere i liten skala, reduser det sikre driftstrykket under oppskalering av produksjonen og reserver et passende prosesstoleranseområde.

2. Optimaliser kryssflythastigheten
Etabler et stabilt grensesjikt og reduser konsentrasjonspolarisering ved membranoverflaten gjennom kryssstrøm, og minimerer derved proteinakkumulering på membranoverflaten ved kilden.

3. Begrens sluttkonsentrasjonen etter konsentrasjon
Definer en konsentrasjonsgrense basert på de fysisk-kjemiske egenskapene til proteinet og unngå for høy fôrkonsentrasjon. For mAbs overskrider den rutinemessige sluttkonsentrasjonen vanligvis ikke 50 mg/ml; for noen aggregerte-utsatte mAbs, bør konsentrasjonen reduseres ytterligere.

4. Kontroller fôrets pH og ledningsevne
Oppretthold en stabil hydratisert partikkelstørrelse på proteinet og unngå molekylær sammentrekning forårsaket av syre/base eller ionestyrkeforstyrrelser-.

(B) Utstyr og driftskontroller

1. Utfør membrankassettintegritetstesting før hver batch
Utfør en boble-punkttest før produksjon av hver batch for å identifisere ødelagte membranfibre. Skadede membrankassetter bør kastes umiddelbart for å forhindre kontinuerlig proteinlekkasje.

2. Standardiser CIP-rengjøringsprosedyren
Kontroller NaOH-konsentrasjonen og kontakttiden. Etter sterkt alkalisk rengjøring, balanser membranmaterialet fullstendig for å redusere risikoen for membranporedeformasjon.

3. Bruk trinnvis diafiltrering
Bruk en bufferutveksling med stort-volum i det tidlige stadiet for å fjerne salter, og senke diafiltreringsstrømningshastigheten når endepunktet nærmer seg for å redusere proteinmotstand og -tap.

 

III. Etablere et prosessdesignrom gjennom DOE (QbD Process Characterization; Gjelder for IND-innlevering)

1. Faktorscreening
Skjerm fem viktige UF/DF-prosessparametere (P): transmembrantrykk, fôrstrømningshastighet, initial proteinkonsentrasjon, fôr-pH og driftstemperatur.
Responsvariabler: beholdt utbytte, proteininnhold i permeatet, membranfluks og prosentandel av høy-molekylære-aggregater.

Gjennom signifikansanalyse identifisere nøkkelfaktorene som bidrar til proteinlekkasje.

2. Responsoverflatemodellering
Velg de fire parameterne med høyest betydning for å konstruere en responsoverflate og analysere interaksjoner mellom parametere. Under mange driftsforhold kan en enkelt parameter forbli innenfor sitt kvalifiserte område, mens kombinasjonen av to parametere kan resultere i proteingjennomtrengning. Slike interaksjonseffekter kan ikke identifiseres gjennom tradisjonelle en-faktor-om gangen--eksperimenter. Basert på modellen, definer et operativt designrom. Så lenge prosessparametrene forblir innenfor dette området, kan effektiv proteinretensjon sikres mens urenheter fjernes ved diafiltrering.

3. Worst-utfordring (kreves for prosesskarakterisering)
Velg prosessparametere i ytterkanten av driftsgrensene for å simulere produksjonsvariasjoner: maksimal TMP, minimum tverrstrømningshastighet og øvre-grense for proteinkonsentrasjon. Kontroller at selv under ekstreme driftsforhold,-målproteintap ikke forekommer i stor skala, og oppfyller dermed kravene til CMC-gjennomgang.

 

IV. Flere analytiske metoder for å identifisere proteiner oppdaget i permeatet og skille mål-mAb, nedbrytningsfragmenter og HCP

Basert på analytisk effektivitet, kostnad og regulatoriske innsendingsscenarier, kan metodene deles inn i to kategorier: rask screening og bekreftende testing. Raske metoder bør prioriteres for rutinemessig prosessovervåking; når unormale avvik oppstår, bør nøyaktige identifiseringsmetoder brukes.

1. UV-spektrofotometri (rask online screening; foretrukket for rutinemessig butikk-gulvovervåking)
Samle permeatet og mål dets A280-absorbans. Dette kan bare avgjøre om protein er tilstede i permeatet og kan ikke skille proteinartene. Den brukes hovedsakelig til rutinemessig prosessovervåking. En kontinuerlig økende A280-verdi indikerer forverret proteinlekkasje og krever umiddelbar suspensjon av diafiltrering og undersøkelse av prosessen.

2. SDS-PAGE-elektroforese (mest brukte kvalitativ identifikasjonsmetode)
Bruk reduserende og ikke-reduserende elektroforese og sammenlign båndposisjonene med mål-mAb i råstoffet:
1) Hvis båndposisjonen er fullstendig konsistent med mål-mAb, har intakt mAb gjennomsyret membranen.
2) Hvis lavere-molekylære-vektsbånd vises, har proteinet gjennomgått hydrolytisk spaltning, og genererer mAb-fragmenter.
3) Hvis båndene er spredt med flere forskjellige bånd, er de fleste vertscelleproteiner (HCP) fra E. coli/CHO-vertsceller i stedet for målproduktet.

3. Høy-størrelses-ekskluderingskromatografi (HPSEC)
Skill komponenter i henhold til molekylstørrelse og sammenlign elueringstidene deres med råstoffkromatogrammet:
- En hovedtopp med samme retensjonstid som mAb indikerer intakt målprotein.
- En topp som elueres tidligere indikerer høy-molekylære-vektaggregater/fragmenter.
- En topp som elueres senere indikerer lav-molekylære-vektsfragmenter.
- Fraværet av en karakteristisk hovedtopp indikerer HCP-urenhetsproteiner.
Denne metoden kan gi kvantitative data og kan inkluderes i undersøkelsesrapporter om prosessavvik; den har høy aksept i klinisk innsendingsmateriale.

4. HCP vert-celleprotein ELISA-setttesting
Hvis protein påvises i permeatet, ELISA-resultatet er forhøyet, og HPSEC viser ingen karakteristisk mAb-topp, kan det lekkede materialet i utgangspunktet bestemmes å være CHO-verts-celleproteiner. Dette indikerer ufullstendig fjerning av urenheter under oppstrømsrensing; urenhetene blir vasket ut under UF/DF-stadiet og representerer ikke produkttap.

5. Verifisering av affinitetskromatografi (protein A-kromatografi)
Protein A binder spesifikt Fc-regionen til mAbs. Last permeatprøven på kolonnen: utseendet til en karakteristisk elueringstopp indikerer tilstedeværelsen av intakt målantistoff; fraværet av en elueringstopp viser at proteinene i permeatet alle er urenhetsproteiner.

6. Massespektrometri (LC-MS) (i-dybdesporbarhet; brukes til undersøkelse av store prosessavvik)
LC-MS kan analysere aminosyresekvensen direkte og nøyaktig bestemme opprinnelsen til proteinet. Den brukes hovedsakelig til undersøkelse av vanskelige eller uvanlige avvik og brukes ikke som en rutinemessig-prosesskontrolltest.

V. Korrigerende handlinger som tilsvarer forskjellige analytiske resultater

1. Intakt mål mAb detektert i permeatet
Reduser transmembrantrykket og den endelige konsentrasjonen etter konsentrasjon; begrense prosessdriftsområdet basert på DOE-resultater; og kontroller membrankassettens integritet.

2. Antistoffnedbrytningsfragmenter påvist i permeatet
Undersøk skjærspenning gjennom hele prosessen og ekstreme pH-verdier; optimalisere oppstrøms viral inaktiveringstrinnet for å redusere proteinspalting.

3. Kun HCP-urenhetsproteiner påvist i permeatet
Ingen justering av UF/DF-parametre er nødvendig. Spor problemet tilbake til de foregående kromatografitrinnene og forbedrer fjerning av urenheter under affinitets- og ionebyttekromatografi.

 

VI. Sammendrag

For å forhindre proteinlekkasje under UF/DF, er tradisjonell prosesskontroll avhengig av historisk erfaring for å definere individuelle punktparametere, som bare kan håndtere stabil produksjon i liten{0}}skala tilstrekkelig. For å sikre stabil ytelse under trinnvis prosess oppskalering-, bør DOE-basert prosesskarakterisering brukes for å etablere et prosessdesignrom med tilstrekkelig toleranse. Intervall-basert parameterkontroll kan kompensere for produksjonsvariasjoner. Når protein er påvist i permeatet, kan et enkelt UV-deteksjonssystem gi en første advarsel, etterfulgt av elektroforese, HPSEC og ELISA for sporbarhet og identifikasjon. Dette tillater nøyaktig differensiering mellom målproduktet og verts-celleurenheter, noe som muliggjør målrettet rotårsaksundersøkelse og korrigerende handlinger. Dette er også en standardisert forskningskomponent som for tiden er inkludert i CMC-dokumentasjonen for mAb-prosjekter.