Membranteknologi og vaksineavklaring (Ⅰ)
Vaksiner kommer fra en rekke kilder, inkludert vevsekstrakter, bakterieceller, viruspartikler, proteiner og nukleinsyrer produsert av rekombinante pattedyrceller, gjær- og insektceller.
Den vanligste metoden for vaksineproduksjon er basert på en innledende gjæringsprosess etterfulgt av rensing. Vaksineproduksjon er en kompleks prosess som involverer mange ulike trinn og prosesser. Å velge riktig rensemetode er avgjørende for å oppnå ønsket sluttproduktrenhet. Avklaring av vaksiner er et viktig skritt som har betydelig innvirkning på produktgjenvinning og påfølgende nedstrømsrensing. Flere teknikker kan brukes for å klargjøre vaksiner. Valg av innsamlingsmetode og utstyr avhenger av batteritype, arten av produktet som samles inn og prosessvæsken. Disse teknikkene inkluderer membranfiltrering (mikrofiltrering, tangentiell strømningsfiltrering), sentrifugering og dypfiltrering (normal strømningsfiltrering). Fra lang erfaring oppnås vaksinehøstavklaring vanligvis ved sentrifugering etterfulgt av dypfiltrering.
De siste årene har membranbaserte teknikker fått en fremtredende plass i vaksineavklaring. Oppstrømsprosesser bruker i økende grad engangsteknologi, så høstingsstrategier må endres. Denne artikkelen gir en omfattende oversikt over forskjellige membranbaserte teknologier og deres anvendelser i vaksineavklaring.
01 Introduksjon
Vaksiner er en kritisk komponent i vår forebygging av infeksjonssykdommer, som fortsatt er en sjokkerende dødsårsak. Mellom 2 og 3 millioner mennesker blir reddet fra difteri, stivkrampe, kikhoste og meslinger hvert år takket være vaksinasjon. Vaksiner dekker et bredt spekter, fra små rekombinante proteiner til hele viruspartikler og hele bakterier. De kan produseres av forskjellige systemer: egg, pattedyrceller, bakterier, etc. På grunn av kompleksiteten og mangfoldet av vaksiner, er det for tiden ingen vanlig renseprotokoll eller mal, til tross for økende interesse for vaksineplattformer.
Vanligvis kan en vaksineprosess deles inn i tre deler: oppstrøms (produksjon og klaring), nedstrømsbehandling (rensing inkludert ultrafiltrering, kromatografi og kjemisk behandling) og formulering (sluttfyllingsoperasjoner). Uavhengig av produksjonssystemet spiller klaring (første fjerning av uønskede stoffer) en nøkkelrolle for å bestemme en robust renseprosess. Et riktig avklaringstrinn fjerner hovedsakelig hele celler, celleavfall, kolloider og store aggregater for å redusere belastningen med nedstrømsbehandling. I noen tilfeller kan klaring også redusere uløselige urenheter, vertscelleproteiner (HCP) og vertscellenukleinsyrer. Som alle andre rensetrinn, må klaringstrinnet optimaliseres for å oppnå maksimalt produktutbytte og renhet samtidig som det tilpasses spesifisiteten og produksjonsbegrensningene til vaksinen.
På grunn av heterogeniteten til vaksinetyper, brukes en rekke teknikker for avklaring, inkludert sentrifugering eller filtrering (tabell 1).
Det kreves vanligvis flere serier av operasjoner for å oppnå ønsket avklaring. Den første operasjonen er designet for å fjerne større partikler (primær klaring) og den andre operasjonen er designet for å fjerne kolloider og andre sub-mikron partikler (sekundær klaring). Lavhastighetssentrifugering fungerer som et engangsavklaringsalternativ, slik at celler og cellerester kan fjernes ved nedbør. Sentrifugering kan håndtere høye faste belastninger og har vært mye brukt i batch- eller kontinuerlig modus og skivesentrifuger. Det krever høye kapitalinvesteringer og vedlikeholdskostnader, og står overfor utfordringer med å skalere opp på grunn av mangelen på en pålitelig nedskaleringsmodell. Noen kommersielle vaksineprodusenter bruker imidlertid sentrifuger i storskala produksjon som involverer høye prosesseringsvolum og flere produksjonsaktiviteter.
Klareringsfiltrering kan utføres ved normal strømningsfiltrering (NFF, også kjent som blindveifiltrering) eller tangentiell strømningsfiltrering (TFF, også kjent som kryssstrømsfiltrering). Det er også spesifikke filtermoduser (dypfiltre) som inneholder positivt ladede materialer og filter-AIDS som forbedrer retensjonen av celleavfall, kolloider og negativt ladede uønskede komponenter.
Membranfiltre holder på partikler ved å utelukke størrelsen og har ikke høy smussretensjonskapasitet, så de er egnet for sekundære klaringstrinn. Både dypfiltre og membranfiltre er enkle å skalere og implementere (enkel systemdesign). I motsetning til NFF brukes TFF hovedsakelig til primær klaring (mikrofiltrering). Membraner med et avskjæringsområde på 0.1-0.65 μm (fortrinnsvis med en åpen kanal) har blitt brukt til å holde på celler, cellerester og andre store forurensninger. Det meste av TFF-utstyr er lineært skalerbart og gjenbrukbart etter rengjøring, noe som reduserer kostnadene for forbruksmateriell for trinnet betydelig.
Avklaringstrinnet ligger mellom oppstrøms- og nedstrømsprosessene og blir noen ganger oversett under utvikling av vaksineprosess fordi tid og ressurser er prioritert for andre rensetrinn, for eksempel kromatografi eller tetthetsgradientsentrifugering.
Selv patenter for vaksinefremstillingsprosesser utelater ofte avklaringstrinnet. Avklaringseffektiviteten påvirker direkte ytelsen til nedstrømsprosessen. Et dårlig optimert klaringstrinn kan påvirke kapasiteten til det steriliserte filteret negativt eller kan forkorte levetiden til den kromatografiske harpiksen. I dag har strammere regulatoriske forventninger en tendens til å få vaksineprodusenter til å produsere renere, velkarakteriserte, men rimelige vaksiner. I dette tilfellet må hvert trinn gis den oppmerksomheten det fortjener. Aktuelle trender tyder på at oppstrømsprosessen beveger seg mot et "renere" ekspresjonssystem (dvs. celler dyrket i serumfrie medier erstatter egg) med økt produktivitet og høyere celletetthet.
Nedstrøms renseprosesser forenkles og strømlinjeformes for å øke renheten til sluttproduktet. For å håndtere disse endringene kan ikke avklaringstrinnet bli en flaskehals. I dette tilfellet møter filtreringsteknologi en ny avklaringsutfordring, som tar opp problemene med økt prosessfleksibilitet, muligheten for engangsbruk og reduserte investeringskostnader.
02 Avklaring av virusvaksiner
Flere typer klaringsmetoder, enten alene eller i kombinasjon, har vært vellykket brukt for å klargjøre innhøstingen i fôrenden av vaksiner.
Pilotskala:1-20L, produksjonsskala: mer enn 20L
2.1 Forholdsregler for virusvaksineavklaring
Mange vaksiner inneholder hele eller deler av viruspartiklene for å danne immunitet mot virusinfeksjon. De faller generelt inn i fire brede kategorier:
Levende svekket vaksine (LAV), som er basert på en svekket stamme av viruset for å redusere virulensen. Svekkede virus kan replikere seg i kroppen, men er ikke patogene.
- Inaktiverte virus (IV) vaksiner, som inneholder kjemisk eller ultrafiolett inaktiverte virus for å eliminere smitte. Viruspartikler kan være komplette, delt eller renset (kun antigene proteiner).
- Viral vektor (VV)-vaksinen er et aktivt, ikke-patogent virus som presenterer antigenet til et patogent virus. Disse nylig utviklede strukturene brukes også til genterapiapplikasjoner.
Viruslignende partikler (VLP-vaksiner), en spesifikk klasse av virale underenhetsvaksiner som etterligner den generelle strukturen til virale partikler, men som ikke inneholder smittsomt genetisk materiale.
I de fleste tilfeller er viruspartiklene helt intakte under klaringstrinnet, selv under lysering av virusvaksinen (spaltningen utføres vanligvis nedstrøms, i et mer renset miljø).
Hovedutfordringen med viral klaring er gjenvinningen av viruspartikler med høy avkastning samtidig som man effektivt fjerner celleavfall, store aggregater og uløselige forurensninger. Som beskrevet i de følgende avsnittene er det flere faktorer som kan forårsake virusnedbrytning eller tap. I tillegg kan virusutbytte være vanskelig å stole på på grunn av den høye variasjonen av virale kvantitative analysemetoder på dette stadiet av prosessen, spesielt for LAV- og VV-vaksiner. For disse vaksinene blir virusutbyttet ofte evaluert ved hjelp av smitteevnetester som plakktest eller TCID 50-test. Det faktum at noen av de høstede forbindelsene kan forstyrre virusets evne til å infisere indikerende celler øker variasjonen til denne kvantitative tilnærmingen.
2.2 Virusvaksineavklaringsstrategi
Virale vaksiner varierer sterkt i størrelse, struktur, form og uttrykkssystemer (tabell 3).
Som et resultat er det generelt ingen mal for nedstrømsprosessene, spesielt avklaringstrinnene. I teorien kan alle tilgjengelige teknikker (lavhastighetsentrifugering, mikrofiltrering TFF, NFF) velges og potensielt kombineres for å klargjøre viruset. Faktisk er suksessen til klaringsmetoder påvirket av ekspresjonssystemet og de fysisk-kjemiske egenskapene til de involverte virusene.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} celler /ml) klaringsmetode, ved bruk av kationiske polymerer, reduserte det dype filtreringsområdet med 4 ganger sammenlignet med tradisjonelle metoder. Denne teknikken gjør det mulig å høste fermentorer med stor kapasitet uten bruk av sentrifuger. Tilsvarende har Riske et al. viste at kitosanbehandling av 40 L cellekulturer (0,02%) inneholdende 1,4-2,6% faste stoffer førte til en 7-dobling i absolutt filterkapasitet etter dypfiltrering.
De nevner også at kitosan ser ut til å forbedre klaringseffektiviteten ved å flokkulere submikronpartikler, som vanligvis legger seg i sentrifuger. Forbehandlings- og flokkuleringsmetoder vil sannsynligvis fortsette å være en del av fremtidige vaksinefiltreringsavklaringer. Penetranter, inkludert sukker, glykoler og aminosyrer, flokkulerer fortrinnsvis virus. Viral flokkulering med osmotisk løsning etterfulgt av 0.2µ mikrofiltrering kan brukes som en omfattende prosess for virusrensing. Penetranter kan stimulere viral aggregering ved å redusere hydreringslaget rundt partiklene for å flokkulere hydrofobe ikke-innkapslede viruspartikler og innkapslede viruspartikler. Selv om penetranter har vist seg å flokkulere virus, har metoden potensial til å være en plattform for fremtidig vaksinerensing, og dens gjennomførbarhet i pilot- eller storskala vaksinerensing er ikke bevist. Flokkuleringsforbehandlingsmetoden, som sannsynligvis vil fortsette å være en del av fremtidig klaring av vaksinefilter, utføres i en 2L fermentor. For potensielt å kunne brukes i storskala produksjonsoperasjoner, må disse metodene valideres på pilot- og produksjonsskala.
2.2.1 Uttrykke systempåvirkning
Avklaringsmetoden avhenger hovedsakelig av typen oppstrøms prosess og ekspresjonssystem, som bestemmer typen og nivået av forurensninger som skal fjernes. Virale vaksiner produseres vanligvis i kyllingembryoer av kontinuerlige cellelinjer fra pattedyr eller fugler eller baculovirus/insektceller, som er et mer komplekst ekspresjonssystem. Noen typer VLP-er kan også produseres av andre heterologe ekspresjonssystemer (bakterier, gjær, planteceller).
2.2.1.1 Virus produsert i kyllingembryo
Vaksiner har blitt produsert i egg i flere tiår. Dette arbeidet dateres tilbake til 1931, da Woodruff og Good Pasture med suksess brukte chorio-allantoic-membranen til fruktbare egg som et substrat for viral vekst. I dag produseres fortsatt mange humane og veterinære vaksiner ved å bruke denne eldgamle prosessen. Den mest kjente er nok sesonginfluensavaksinen. Prinsippet er å inokulere kyllingegg med virus av interesse og deretter replikere i den chorio-allantoiske membranen. Etter reproduksjon samles og renses allantoisvæske rik på virale partikler.
Allantoisk væske er et utfordrende klaringsfôr. Dens høye mineral- og proteininnhold (inkludert ovalbumin) gir den en høy viskositet. Allantoisk væske inneholder også essensielle vevsforbindelser fra kyllingembryoer, som fjær, nebb, blodårer eller blodceller. På grunn av det høye tørrstoffinnholdet er sentrifugering med lav hastighet det foretrukne alternativet for primær klaring, noe som typisk resulterer i en utvinningsgrad på ca. 70 %. Primær klaring ved bruk av filtreringsteknikker er imidlertid også mulig. For NFF har polypropylen- og cellulosebaserte dypfiltre gode allantoisvæskeoppsamlingsevner. Overflatefiltre laget av polypropylen- eller cellulosebaserte dypfiltre kan ha en kapasitet på 150-210 L/m² og redusere turbiditeten i matestrømmen med opptil 3 ganger. Den åpne matekanal TFF-anordningen er også egnet for allantoisvæskeklaring, da enheten er mer egnet for minimalt trykktap gjennom matekanalen, og dermed reduserer kanalblokkering.
Det sekundære avklaringstrinnet kan enkelt gjøres med NFF. En kombinasjon av polypropylen, cellulose og glassfibermaterialer viser generelt god effektivitet, og et alternativ til det sekundære klaringstrinnet er å bruke TFF og en {{0}}.65μm eller 0.45μm mikrofiltreringsmembrananordning og drive osmotisk fluks kontroll. En åpen kanal TFF-enhet med en hydrofil PVDF eller en hydrofil PES-membran kan brukes i dette trinnet.
Det er viktig å merke seg at virale partikler kan være assosiert med uløselig ruskmateriale, noe som kan redusere viral produksjon betydelig under klaring. Bruk av en saltløsning kan redusere denne assosiasjonen mellom influensavirus og faste fragmenter, noe som resulterer i en omtrent to ganger økning i produksjonen uten å påvirke integriteten til viruspartiklene.
2.2.1.2 Virus produsert i påfølgende pattedyr- og fuglecellelinjer
Nylig har noen virale vaksiner gått bort fra eggbaserte prosesser til fordel for cellekulturbaserte prosesser (spesielt for influensavaksiner). Hovedårsaken til dette byttet er å forhindre vaksineproduksjonsproblemer knyttet til embryonale egg (dvs. mangel på eggtilførsel som kan oppstå ved utbrudd av fjørfesykdom). Som et resultat er mange typer vaksiner og virale vektorer for tiden utviklet ved bruk av kontinuerlige cellelinjer fra pattedyr eller fugler, konvensjonelle cellelinjer (som Vero, MDCK eller HEK293 cellelinjer), eller proprietære cellelinjer.
Avhengig av ekspresjonssystemet kan viruset forbli inne i cellen, noe som krever et cellelysetrinn, eller det kan forbli utenfor cellen (lyse eller spirende). Den faste belastningen og det løselige innholdet oppnådd fra cellekultur er mye renere enn den allantoiske væskefasen. Som et resultat er NFF-teknologien enklere å implementere og kapasiteten er betydelig høyere. Imidlertid er filtreringskapasiteten svært avhengig av cellekulturforhold, slik som celletetthet eller cellelevedyktighet ved høsting. Disse parameterne påvirker mengden celleavfall og makroaggregater som kan tette dype filtre og membraner, noe som resulterer i redusert kapasitet.
Thomassen et al gir et godt eksempel på NFF-avklaring. Brukes i produksjonsprosessen for inaktivert poliovirus (IPV). Vero-celler dyrket på mikrobærere ble brukt for viral spredning med en celletetthet på {{0}}.78 x 106 celler/ml TOI. En 75 μm sikt i rustfritt stål brukes til forklaring for å fjerne mikrobærere fra innhøstingen. Dobbeltlagsgraderingen avklares ved hjelp av et tetthetsdypfilter (0.2-2.0μm), etterfulgt av et sterilisert filter.
Den valgte skalerbare engangsenheten ble vellykket brukt til fremstilling av Sabin IPV-materiale for kliniske forsøk i 350 L skala. Avhengig av virusserotypen oppnås en virusgjenopprettingsrate på 86 til 96 prosent.
2.2.1.3 Baculovirus/viruslignende partikler produsert i insektcellesystemet
Betraktningen av baculovirus/insektcellesystemer for storskala vaksineproduksjon er relativt ny, men tiltrekker seg økende interesse innen virale vektorer og VLP-er. Hovedfordelen med dette systemet er at det involverer kortvarig (ikke nødvendig å etablere cellelinjer) og sikker (ingen fullstendig viralt DNA) produksjon. Det er også noen ulemper, som behovet for fjerning av baculovirus og produktstabilitet.
Cervarix, en VLP-vaksine mot human papillomavirusinfeksjon produsert av GlaxoSmithKline, er den første humane vaksine som er kommersielt produsert i insektceller. En rekke vaksiner basert på VLP-er og rAAV-vektorer produsert i baculovirus-infiserte insektceller er for tiden under utvikling. Insektcellelinjer avledet fra høsthærorm Spodoptera frugiperda (Sf9 og Sf21) og kålbendorm Trichoplusia ni (BTI-TN5B1-4-celler) er de mest brukte på grunn av deres evne til å vokse i suspensjon, noe som forenkler amplifisering av oppstrøms. behandle. Etter å ha vokst til ønsket tetthet av levende celler, blir disse cellene infisert med rekombinant baculovirus i den eksponentielle cellevekstfasen for proteinekspresjon. Det store genomet til baculovirus tillater ekspresjon av fem eller flere forskjellige proteiner, som matcher kompleksiteten til VLP og virale vektorer.
Bernard et al. beskrev nedstrøms prosessen med insektcellekultur. Prosessen er svært variabel, noe som gjenspeiler mangfoldet av proteiner produsert med denne teknikken. Det første trinnet i rensesekvensen er sterkt påvirket av volumkarakteristikkene til bioreaktoren (dvs. celletetthet og levedyktighet), eller av arten av produktfrigjøringen (utskilt ved knoppdannelse eller cellelyse). Baculovirusinfeksjon av insektceller kan forårsake cellelyse innen 3-5 dager. Ødeleggelsen av celler kan føre til en økning i proteolytisk aktivitet og andre miljøfaktorer som kan føre til nedbrytning av rekombinante proteiner.
Det har vært forsøk på å utvikle bakulovirus med lavere evne til å starte cellelyse. Baculoviruset lyserer mindre enn 10 prosent av infiserte insekter.
Cellelyse kan utføres ved hjelp av forskjellige metoder, for eksempel fryse-tine, vaskemidler, homogenisatorer eller ultralydbehandling. Insektceller har ingen cellevegg og løses derfor raskt opp. Selv om ultralydbehandling har blitt rapportert i mange benkeprosesser, brukes den sjelden i eksperimentell eller kommersiell skala. Den vanligste metoden er å bruke en homogenisator for å ødelegge celler i nærvær av et vaskemiddel med lav konsentrasjon (0,1 % Triton X-100 eller NP-40). Bruken av vaskemidler og mikrofluidisering eller osmotisk påvirkningshomogenisering har vært vellykket brukt i mange storskala produksjonsprosesser. Vanligvis er insektceller suspendert i lyseringsbuffere (50 mM TRIS pH7,7, 300 mM NaCl, 5 % glyserol, 0,2 mM PMSF og proteasehemmere), hvorunder Triton-X100 tilsettes til en sluttkonsentrasjon på 0,1 %, etterfulgt av mild ultralyd eller mikrofluidisering. Blandingen sentrifugeres deretter for å fjerne uløselige partikler.
På dette stadiet kan lysatet virke veldig uklart og er vanskelig å filtrere med et 0.45μm-filter. Noen ganger kan tap på opptil 30 % observeres under pyrolyseavklaringstrinnet. Tilsetning av benzoenzymer på spaltningsstadiet bidrar til å løse filtreringsproblemet. Rengjøring av cellene med fosfatbufret saltlake etter høsting og rask "frys-tine" i et høyt salt (500 mM NaCl) som inneholder crackingbufferen, hjelper til med å fjerne aggregatene.
Klargjøring av VLP-er og virale vektorer produsert av insektceller skjer etter cellelyse (ved kjemisk eller mekanisk behandling), som frigjør ikke bare virale partikler, men også store mengder cellulær nukleinsyre. Insektceller er i stand til å vokse med høy celletetthet, fra 1-9.10 6 celler/ml. Derfor bør avklaringstrinnet omhandle høy celletetthet, høyt nukleinsyreinnhold og om mulig fjerning av baculoviruspartikler. For å gjøre saken mer komplisert kan VLP-er eller virale vektorer og baculovirus ha lignende størrelser (baculovirus er 60-80 nanometer brede og 300-400 nanometer lange). På grunn av den høye celletettheten har sentrifugering vært den foretrukne teknikken for primær klaring i flere tiår. Membranprosesser ser imidlertid ut til å være et veldig attraktivt alternativ fordi skalerbarhet er lett å definere.
Dypfiltre har blitt brukt effektivt i nedstrømsprosessen av trelags rotaviruslignende partikler. På laboratorienivå brukes CsCl-densitetsgradient-ultrasentrifugeringsmetoden ofte for å rense disse komplekse partiklene. Forskerne evaluerte ikke bare klaringstrinnet til dypfilteret, men også hele nedstrømsprosessen (Triton X-100-spalting og dypfiltrering, etterfulgt av ultrafiltrering og utelukkelse av partikkelstørrelse). Resultatene viser at utbyttet av CsCl-tetthetsgradient kan nå 37%.
Ultrasentrifugalmetoden er omtrent 10%. Som et annet eksempel ble 0,45 μm hule fibre og 500 kDa fibre med fin diameter brukt til å gjenvinne og konsentrere HIV-lignende partikler produsert i insektceller. I denne studien ble skjærkraften til hule fibre optimalisert basert på celleintegritet. Resultater En prosess med lav skjærkraft ble etablert for å erstatte ultrasentrifugering av bordsukkergradient.
Prosessen har potensial til å bli brukt til masseproduksjon. Dype filtre har også blitt brukt med hell i produksjonen av rekombinante adeno-assosierte virus. Cellelyse ble utført med en to-stempels mekanisk celle-jammer, etterfulgt av nukleasebehandling. I avklaringstrinnet ble 1,2μm glassfiber dypt filterelement brukt, etterfulgt av to lag med 0.8μm hydrofil PES og 0.2μm hydrofil PES. Filtre med proporsjonal størrelse brukes for prosesspartier fra mindre til 200 L-størrelser. Dype filtre har blitt brukt med hell, og TFF-klassifiseringer med flate filmer eller hule fibre på 0,2 µm eller 0,45 µm har også blitt rapportert å være svært effektive.
Studien av Tecnologica (IBET) ved Oeiras Institute of Experimental Biology i Portugal brukte NFF til å utføre avklaring av hepatitt C VLP uttrykt av baculovirus uten sentrifugering. Nominelt klassifiserte polypropylenfiltre (10,5,0.6 og 0.3μm) filtre brukes for å klargjøre VLP-høsting. De samme filtrene med 0.6μm og 0.3μm porevurderinger brukes til filtrering i VLP-høstesentre. Alle filtrater som ble studert ble testet for HCV-VLP-gjenvinningshastigheter, og de anbefalte filtreringsmetodene ble sammenlignet. Resultatene er vist i tabell 4.
Resultatene viste at 5μm-0.3μm-filteret hadde den høyeste produktgjenvinningen (100%) for direkte høstet hepatitt C VLP-fôr. Polypropylen 0,6 μm-filteret hadde den høyeste produktgjenvinningen (82 %) for sentralmatingen, og DNA-clearancen til vertscellen var ca. 70 %.
2.2.1.4 Viruslignende partikler produsert i bakterie- eller gjærsystemer
Typen klaringsmetode for VLP-vaksiner uttrykt i bakterie- eller gjærsystemer avhenger av frigjøring av VLP til ekstracellulære mediatorer. Hvis VLP-er ikke kan skilles ut effektivt, kan cellelyse eller andre ekstraksjonstrinn være nødvendig før selve klaringstrinnet. Selv om dette er gullstandarden i proteinklaringsindustrien, sentrifugering (kontinuerlig eller batch) uttrykt i bakterie- eller gjærbaserte systemer, har membranprosesser nylig blitt et veldig attraktivt alternativ på grunn av deres enkle skalerbarhet og kompatibilitet med engangsbruk. behandlinger.
Richter og Topell forklarer bruken av sentrifugering, TFF, eller en kombinasjon av begge ved fremstilling av VLP-er produsert i klaret E. coli. I arbeidet deres ble 0.45m TFF-membraner brukt til å fortynne og klarne de homogeniserte E. coli-homogenatene ved en temperatur på 5 grader. De bemerker også at membranbasert TFF er egnet for håndtering av høyviskositetsavlinger, fortrinnsvis ved bruk av TFF-enheter med åpne kanalkonfigurasjoner.
Sentrifugal avklaring er også evaluert som et alternativ til TFF. I dette tilfellet ble det resulterende homogenatet ikke fortynnet og sentrifugert ved 4 grader i 105 minutter, 10000g. Uten å overføre det myke belegget ble supernatanten helt ut av partiklene og sentrifugert på nytt ved 4 grader og 10 000 g i 60 minutter. Supernatanten ble deretter fjernet fra de foreliggende partikler, fortynnet med EB-buffer (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris Base, 5,0 mM EDTA, 10 % (v/v) Triton X-100) 1:2 og filtrert på en 0,22 m steril filteranordning. Videre bearbeiding. Oppskaleringsprosessen for produksjon av denne VLP-vaksinen i E. coli i 800L skala ble også rapportert avklart ved kombinasjonen av sentrifugering og TFF.
Den rekombinante hepatitt E-vaksinen HEV 239 er lisensiert i Kina for immunisering av voksne 16 år og eldre. Vaksineantigener (VLP) uttrykkes i E. coli, og oppskalering av antigenproduksjonsprosessen har vist seg å være på en 50L skala. Produktet ble ekstrahert ved å sprekke E. coli og inklusjonslegemene ble separert fra cellefragmentene ved kraftig vasking med en buffer inneholdende 2 % Triton X-100 og deretter oppløst med en 4 M ureahomogenisator. TFF klargjør humant papillomavirus VLP produsert i Saccharomyces cerevisiae (15L). Cellelysatet behandlet med nuklease ble klarnet ved kryssstrømsmikrofiltrering i transfiltreringsmodus ved bruk av 0,65 μm hulfiberfilter. Den samme prosessen brukes i vaksineproduksjon. Selv om bare en håndfull VLP-baserte vaksiner har nådd kommersiell skala, er flere VLP-baserte vaksiner under utvikling, hvorav de fleste er avklart ved hjelp av sentrifugering eller membranteknologi.
Begrenset av påvirkning av plass, vil vi dele andre halvdel av innholdet i neste kapittel. I neste artikkel vil vi dele noen tilfeller av vaksineavklaring og bruk av relevante membrankomponenter.
Som det første selskapet i lokaliseringskretsen har Guidling Technology akkumulert tilstrekkelig relevant erfaring innen vaksineavklaring. Guidling Technology er et utviklings- og produksjonsselskap med fokus på biofarmasøytisk og cellekultur, rensing og separasjon. Produktene er mye brukt i biomedisin, diagnose, industriell væskefiltrering, deteksjon, klaring, rensing og konsentrasjonsprosess; Guidling har med suksess utviklet ultrafiltreringssentrifugerør, ultrafiltrerings-/mikrofiltreringsmembrankassett, virusfjerningsfilter, tangentiell strømningsfilterenhet, dyp membranstabel, etc., som fullt ut oppfyller bruksscenarioene for biofarmasøytisk og cellekultur.
Våre membraner og membranfiltre er mye brukt i konsentrasjon, ekstraksjon og separasjon av forfiltrering, mikrofiltrering, ultrafiltrering og nanofiltrering. Vårt brede utvalg av produktlinjer, fra små laboratoriefiltrering til engangsbruk til filtreringssystemer av produksjonstype, sterilitetstesting, fermentering, cellekultur og mer, kan møte behovene til testing og produksjon.