Forholdsregler for bruk av ultrafiltreringsrør
(1) Velg riktig ultrafiltreringsrør. Generelt bør molekylvekten som skal beholdes ikke være større enn 1/3 av molekylvekten til målproteinet. For eksempel, hvis molekylvekten til målproteinet er 35 kDa, kan ultrafiltreringsrøret med 10 kDa molekylvekt velges. Hvis molekylvekten til målproteinet er ca. 10 kd, kan et ultrafiltreringsrør med en molekylvekt på 3KD brukes. Les bruksanvisningen nøye og vær oppmerksom på de forskjellige toleransene til ultrafiltreringsmembraner for forskjellige kjemikalier.
(2) Den nykjøpte ultrafiltreringen er tørr. Tilsett ultrarent vann før bruk, og vannet vil passere fullstendig gjennom membranen. Foravkjøl den i et isbad eller kjøleskap i noen minutter. Hell deretter ut vannet og tilsett proteinløsningen. Mengden som tilsettes skal ikke overstige den hvite linjen på toppen av røret. Operasjonen skal være lett. Før tilsetning av proteinløsning, må ultrafiltreringsrøret settes inn på is for forhåndskjøling.
(3) Balanse. Både masse og tyngdepunkt bør balanseres. Merk at hastigheten og akselerasjonen ikke bør være for høy, ellers vil ultrafiltreringsmembranen bli direkte skadet. Start sentrifugal ultrafiltrering (sentrifugeforkjøling til 4 grader). Etter at turtallet til forskjellige sentrifuger er omdannet til G, er det annerledes. Juster sentrifugens akselerasjon til laveste gir for å redusere trykket på membranen. Merk at du må vente til sentrifugen når målhastigheten før du forlater sentrifugen, ellers når det er et problem med sentrifugen, kan du ikke håndtere det første gang. Retningen til membranen og den roterende akselen skal justeres i henhold til instruksjonene (ved vinkelroterende sentrifuge er membranen vinkelrett på akselen). Ved praktisk bruk er hastigheten generelt lavere enn i manualen, noe som kan forlenge levetiden til sentrifugalrøret.
(4) Når den er konsentrert til de resterende 1 ml, ta 50 ul bufferløsning og tilsett 10 ul for å strømme gjennom for å se om den blir blå, for å vurdere om ultrafiltreringsrøret lekker protein. Hvis røret lekker, hell det øvre laget og flyt gjennom det nye røret og start ultrafiltrering. For nøyaktig å bedømme om røret lekker, sentrifuger med 5mgml BSA i 10 minutter, ta deretter gjennom, kjør proteinlim eller Bradford for grov måling, og fortsett å tilsette den gjenværende proteinløsningen for konsentrasjon (operer på is for å forhindre at proteinet blir oppvarmet) til alle de konsentrerte løsningene er tilsatt. Vær oppmerksom på om det skjer proteinutfelling under sentrifugering, noe som resulterer i rørblokkering. Hvis nedbør oppstår, finn ut den spesifikke årsaken til nedbør, om proteinkonsentrasjonen er for høy eller bufferen er upassende; Førstnevnte kan løses ved samtidig ultrafiltrering med flere ultrafiltreringsrør for å redusere konsentrasjonen. Sistnevnte er å endre forskjellige bufferløsninger til proteinet ikke utfelles.
(5) De foregående trinnene brukes til å konsentrere protein. Hvis du ønsker å bytte buffer, når den totale proteinløsningen er konsentrert til ca. 1 ml, tilsett forsiktig en ny buffer (ultrafiltrering gjennom 0.22um ultrafiltreringsmembran), og konsentrer deretter til ca. 1 ml i tre påfølgende ganger. Det endelige volumet av den siste konsentrasjonen avhenger av den nødvendige proteinkonsentrasjonen, som vanligvis ikke er mer enn 500 ul, eller den kan konsentreres til mindre enn 200 ul. I henhold til volumkonsentrasjonen på minst 10 ganger hver gang, kan den nå mer enn 1000 ganger tre ganger, noe som i utgangspunktet kan oppnå formålet med å endre bufferen.
